SCD-Universite de Rennes 1 Évaluation de la génotoxicité des contaminants environnementaux, production de lignées bio-senseurs et mesure de l'activité enzymatique du cytochrome P450 2E1 dans les cellules d'hépatome humain HepaRG Evaluation of genotoxicity of environmental contaminants,production of bio-sensor cell lines and measurment of CYP2E1 enzymatic activity Cytochrome P450CYP2E1GénotoxicitéChlorzoxazone cytochrome P450CYP2E1GenotoxicityChlorzoxazone Cytochrome P450 Thèses et écrits académiques Toxicologie génétiqueThèses et écrits académiques Maladies de l'environnement Thèses et écrits académiques PolluantsThèses et écrits académiques L'exposition humaine aux contaminants environnementaux est inévitable du fait de leur présence dans l'eau, l'air et l'alimentation. La plupart d'entre eux sont reconnus comme étant mutagènes et/ou carcinogènes chez l'animal mais ils sont souvent seulement suspectés de l'être chez l'Homme. Le manque de connaissance vis-à-vis des substances chimiques a conduit l'UE à lancer le programme REACH avec l'objectif d'évaluer la toxicité d'environ 30 000 molécules. Cette évaluation nécessiterait l'utilisation de plus de 4 millions d'animaux et la pertinence controversée de ces modèles pourrait aboutir à des conclusions discutables. Les méthodes in vitro sont considérées comme une alternative potentielle à l'expérimentation animale. Néanmoins, le choix du modèle cellulaire et des conditions expérimentales restent à préciser. Les hépatocytes humains en culture primaire représentent le modèle le plus pertinent en toxicologie malgré de nombreuses contraintes (variabilité inter-individuelle, changements phénotypique précoces, obtention aléatoire). La lignée HepaRG constitue une alternative intéressante puisque ces cellules peuvent proliférer de manière illimitée et expriment les EMXs à des niveaux proches des hépatocytes humains. L'expression de ces enzymes restant stable pendant plusieurs semaines, ce modèle permet l'évaluation du risque lié à une exposition chronique aux contaminents environnementaux, essentielle en génotoxicité. Il reste cependant nécessaire de caractériser plus amplement cette lignée vis-à-vis des EMXs et de l'adapter aux tests de toxicologie actuels. Dans ces travaux, nous avons développé un test haut débit utilisant la quantification in situ des histones phosphorylées γH2AX avec l'objectif de pouvoir évaluer le risque génotoxique d'une exposition unique ou répétée aux contaminants environnementaux. Ce test a été validé avec succès par l'évaluation de la génotoxicité associée à une exposition de 1, 7 et 14 jours pour 10 polluants. Nous avons ensuite généré des lignées recombinantes biosenseurs, dérivées du modèle HepaRG et permettant d'identifier les xénobiotiques altérant l'expression transcriptionnelle des EMXs. Par transfection transitoire, nous avons dans un premier temps validé à l'aide d'inducteurs prototypiques et de nos 10 contaminants nos constructions contenant le gène rapporteur de la luciférase sous le contrôle des promoteurs de plusieurs EMXs. Ensuite, nous avons généré des lignées stables exprimant la GFP comme gène rapporteur et permettant une détection rapide des xénobiotiques capables d'induire l'expression des EMXs. Parmi les EMXs, le CYP2E1 joue un rôle important en santé humaine. En effet, cette enzyme induite dans certaines conditions physiopathologiques comme le diabète et l'obésité est responsable de l'activation de nombreux procarcinogènes et est à l'origine d'une production d'EROs. Les cellules HepaRG pourraient constituer un modèle pertinent pour l'étude du CYP2E1. Cependant, l'expression et l'activité de cette enzyme au sein de ce modèle nécessitent d'être mieux caractérisées en regard des données discordantes de la littérature. A l'aide de la chlorzoxazone, un marqueur spécifique de l'activité du CYP2E1, nous avons démontré l'influence du métabolisme de phase II sur l'activité apparente du CYP2E1. Nous proposons ici quelques recommandations afin de mieux quantifier l'activité du CYP2E1 sur les hépatocytes humains et sur le modèle HepaRG à l'aide la chlorzoxazone. Human exposure to toxic chemicals is virtually unavoidable due to contamination of air, water and food. A number of environmental contaminants are recognized as mutagenic and/or carcinogenic in animal but they are often only suspected to have similar effects in Humans. The lack of knowledge on the effects of most industrial-made chemicals has led the EU to launch the REACH program with the aim of evaluating the toxicity of more than 30.000 molecules. Such evaluation would require the use of at least 4 millions of animals for an estimated cost of 2.8 billions €. While the relevance of these in vivo models remains controversial. Electronic Thesis or DissertationText fr application/1 : 8620 Kohttps://ecm.univ-rennes1.fr/nuxeo/site/esupversions/671428e9-1dab-4b13-b335-1b19cd93d1fb Quesnot Nicolas 1985-07-03 FR 188801685 quesnotnicolas@hotmail.fr 2015REN1B005 http://www.theses.fr/2015REN1B005 2015-04-30 Biologie et sciences de la santé Universite de Rennes 1thesis.degree.grantor_1 02778715X Doctorat Université européenne de BretagnepartenaireRecherche_1 139075119 non ouiLoyerPascalintervenant_1146672208RobinMarie-Anneintervenant_2080922414 Vie-Agro-SantéecoleDoctorale_1 13908620X Foie, Métabolismes et CancerpartenaireRecherche_2 179960261 ddc:610 LoyerPascalRobinMarie-AnneUniversite de Rennes 1Sciences et technologie, medecine, pharmacie, odontologie, droit, economie, gestion, philosophieVie-Agro-SantéÉcole doctorale Vie-Agro-Santé (Rennes)Université européenne de Bretagne Pôle de recherche et d'enseignement supérieur de Bretagne Foie, Métabolismes et Cancer ASCII PDF 8827027 restriction 2015-04-30 2017-04-30 restriction 2015-04-30 2017-04-30