| Characterization of nuclear ubiquitin ligases in the yeast Saccharomyces cerevisiae (Caractérisation d'ubiquitine ligases nucléaires chez la levure Saccharomyces cerevisiae) | ||
Lazarewicz, Natalia - (2023-09-29) / Universite de Rennes, Université de Wrocław - Characterization of nuclear ubiquitin ligases in the yeast Saccharomyces cerevisiae Langue : Anglais Directeur de thèse: Rabut, Gwenaël; Wysocki, Robert Laboratoire : IGDR Ecole Doctorale : SVS Thématique : Sciences de la vie, biologie, biochimie | ||
Mots-clés : E3 ligases, ubiquitination, test de complémentation de fragments de protéines (PCA), NanoLuc, Ubiquitine-ligase, Ubiquitinylation, Saccharomyces cerevisiae, Luciférases Résumé : L'ubiquitination est l’un des principaux types de modification post-traductionnelle des protéines. Cette cascade est responsable de l'ajout d'une petite protéine, l'ubiquitine, à la protéine dite substrat et joue un rôle crucial dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires. Des perturbations de ce mécanisme d’ubiquitination sont à l'origine de nombreuses maladies humaines, telles que le cancer ou des troubles neurodégénératifs. La liaison de l'ubiquitine est catalysée par une cascade enzymatique par quatre classes principales d'enzymes, parmi lesquelles les ligases E3 sont le groupe le plus important, ce qui affecte directement la spécificité des processus d'ubiquitination. Il semble donc que ces enzymes jouent un rôle clé dans l'ubiquitination correcte de substrats spécifiques et peuvent être des cibles potentielles dans le traitement de maladies causées par des perturbations dans les cascades d’ubiquitination. Un nombre limité de paires E3/substrat ont été décrites jusqu'à présent, et celles décrites sont principalement connues par une approche biochimique qui ne correspond pas entièrement aux conditions physiologiques de la cellule. L'objectif de cette thèse était d'étudier les interactions et les substrats putatifs de certaines ligases E3 dans les cellules vivantes afin de maintenir les conditions physiologiques du fonctionnement de ces enzymes. Les travaux ont été réalisés en plusieurs étapes, qui ont consisté à : l’optimisation d'un protocole à haut débit pour détecter les interactions/substrats E3 putatifs dégradés dans une cellule vivante, la réalisation d'une étude systématique à haut débit pour identifier de paires d'interacteurs de la ligase E3 et des résidus pertinents pour leur liaison, la vérification de l'interaction des enzymes E3-E2, la réalisation d'une étude systématique à haut débit pour identifier de nouveaux substrats putatifs de la ligase E3 destinés à la dégradation via ces voies, la vérification de l'autoubiquitination du domaine RING in vitro. Nous avons utilisé des techniques in vivo modernes basées sur la plus petite et la plus brillante luciférase connue, appelée NanoLuc, y compris le test de complémentation des protéines (PCA) optimisé pour le criblage à haut débit des interactions dans les cellules. Au total, nous avons testé environ 6000 interactions potentielles pour chacune des ligases. Les souches ont toutes été soumises à des mesures de luminescence grâce auxquelles nous avons identifié plusieurs nouvelles interactions non encore décrites dans la littérature. En outre, sur la base de la technique optimisée, nous avons effectué un criblage afin de trouver des changements de protéines à l'échelle du protéome après la mutation de la ligase choisie. Nous n'avons pu détecter que quelques protéines régulées positivement, dont le niveau accru peut suggérer leur dégradation dérégulée après la désactivation de la ligase. Pour résumer, ce travail a identifié les interactions E3/interacteur et E3/E2 et étudié les substrats putativement dégradés dans la levure, et servira de base à d'autres recherches visant à mieux comprendre le fonctionnement du réseau d'ubiquitination dans les cellules. Résumé (anglais) : Ubiquitination is one of the main types of post-translational modification of proteins. This cascade is responsible for adding a small protein, ubiquitin, to the so- called substrate protein and plays a crucial role in regulating many cellular functions. Disturbances of this ubiquitination mechanism are the cause of many human diseases, such as cancer or neurodegenerative disorders. Ubiquitin binding is catalyzed by an enzymatic cascade by four main classes of enzymes, among which E3 ligases are the most important group, which directly affects the specificity of ubiquitination processes. It therefore appears that these enzymes play a key role in the correct ubiquitination of specific substrates and may be potential targets in the treatment of diseases caused by disturbances in the ubiquitination cascades. A limited number of E3/substrate pairs have been described so far, and those described are mainly known by a biochemical approach that does not entirely correspond to the physiological conditions of the cell. The objective of this thesis was to study the interactions and the putative substrates of certain E3 ligases in living cells in order to maintain the physiological conditions of the functioning of these enzymes. The work was carried out in several stages, which consisted of: optimization of a high-throughput protocol to detect degraded putative E3 interactions/ substrates in a living cell, performing a systematic high-throughput study to identify pairs of E3 ligase interactors and relevant residues for their binding, verification of E3-E2 enzyme interaction, performing a systematic high- throughput study to identify new putative E3 ligase substrates for degradation via these pathways, verification of the autoubiquitination of the RING domain in vitro. We used modern in vivo techniques based on the smallest and brightest known luciferase, called NanoLuc, including the Protein Complementation Assay (PCA) optimized for high- throughput screening of interactions in cells. In total, we tested around 6000 potential interactions for each of the ligases. The strains were all subjected to luminescence measurements thanks to which we identified several new interactions which have not yet been described in the literature. Furthermore, based on the optimized technique, we performed a screen to find proteome- wide protein changes after the chosen ligase mutation. We were only able to detect a few upregulated proteins, the increased level of which may suggest their dysregulated degradation after ligase inactivation. In summary, this work has identified E3/interactor and E3/E2 interactions and investigated putatively degraded substrates in yeast, and will serve as the basis for further research aimed at better understanding how the ubiquitination network functions in cells. Identifiant : rennes1-ori-wf-1-18209 | ||
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